一、實驗準備：樣品制備與設備校準

1.1 樣品制備核心原則

熒光標記策略：

選擇光穩定性高的染料（如Alexa Fluor 647、ATTO 647N），避免信號快速衰減。

控制標記密度（5-10個分子/μm2），防止熒光團聚集導致信號失真。

樣品固定與滲透：

生物樣品：多聚甲醛固定（4%濃度，室溫10分鐘），保留細胞結構。

滲透處理：用0.1% Triton X-100處理10分鐘，增強染料滲透性。

抗淬滅處理：

封片劑：使用ProLong Gold等防淬滅介質，延長熒光信號持續時間。

避光操作：所有步驟在暗室或黃光環境下進行。

超薄切片制備：

樹脂包埋：樣品經梯度脫水（50%、70%、90%、****乙醇）后，用EPON 812樹脂滲透并聚合。

超薄切片：用Leica UC7超薄切片機切取50-100nm厚切片，附于載玻片。

1.2 設備校準步驟

激光共軸對準：

調整激發光（通常488nm/594nm）與 depletion光（592nm/775nm）的共軸性，確保兩束光在樣品平面完全重疊。

使用熒光珠樣品（如TetraSpeck）輔助校準，觀察點擴散函數（PSF）對稱性。

光闌與濾光片調整：

調節空間光調制器（SLM）或相位板，優化depletion光斑形狀（如環形或高斯分布）。

選擇帶通濾光片（如605-705nm），阻斷激發光與depletion光殘余信號。

探測器靈敏度設置：

光電倍增管（PMT）：電壓設置在600-800V，平衡信號強度與噪聲。

科學級CCD：曝光時間100-500ms，幀率1-10fps，根據信號強度調整。

二、操作技巧：參數設置與成像優化

2.1 關鍵參數調節

激發光強度：

初始設置：1-5%激光功率（如1μW），逐步增加至信號飽和前。

動態調整：時間序列成像時，每幀降低5%功率，延緩光漂白。

Depletion光強度：

分辨率依賴：強度越高，有效PSF越小（通常20-80%*大功率）。

優化策略：從低強度（20%）開始，觀察信號衰減與分辨率提升的平衡點。

掃描速度與像素停留時間：

快速掃描（1000Hz）：像素停留時間1μs，減少光毒性但可能降低信噪比。

慢速掃描（100Hz）：像素停留時間10μs，提升信號強度但增加漂白風險。

像素尺寸設置：

根據Nyquist準則：像素尺寸≤光學分辨率/2.5（如STED分辨率50nm，像素尺寸≤20nm）。

2.2 成像模式選擇

2D STED：

橫向分辨率提升至30-50nm，適用于細胞膜、細胞器等平面結構觀察。

調整相位板為“donut”模式，增強軸向抑制效果。

3D STED：

軸向分辨率提升至100-150nm，需結合相位板（如4Pi配置）或雙物鏡系統。

優化z軸步進（50-100nm），避免層間信號串擾。

時間序列成像：

動態過程觀察（如囊泡運輸）：間隔50-100ms，總時長≤1分鐘，控制總光劑量。

2.3 實時監控與調整

圖像預覽：

低倍率（60×）掃描全貌，定位目標區域后切換至高倍率（100×）。

觀察信號強度與背景比（SBR），SBR≥3時視為有效信號。

自動對焦與漂移校正：

啟用硬件自動對焦（如尼康Perfect Focus）或軟件算法（如ImageJ StackReg）。

每5分鐘執行一次校正，尤其適用于長時間成像。

多色成像通道對齊：

使用熒光珠樣品校準色差，調整各通道的x/y偏移量（通常≤50nm）。

三、數據處理：從原始數據到科學結論

3.1 圖像預處理

去噪：

小波變換：應用Daubechies 4小波，閾值設為噪聲標準差的2倍。

中值濾波：3×3內核，去除鹽椒噪聲。

背景扣除：

滾動球算法：半徑設為圖像平均PSF的2倍（如50nm）。

頂帽變換：結構元素尺寸與目標結構相當。

圖像配準：

多幀對齊：應用TurboReg插件，基于互信息準則。

3.2 超分辨重建

反卷積算法：

Richardson-Lucy：迭代次數5-10次，避免過度銳化。

Weiner濾波：信噪比參數設為0.01-0.1，平衡分辨率與噪聲。

STED專用重建軟件：

Huygens STED模塊：輸入PSF文件，啟用“STED Deconvolution”模式。

分辨率評估：測量熒光珠的FWHM（全寬半高），驗證理論分辨率（如30nm）。

3.3 定量分析方法

熒光強度統計：

ROI選擇：使用自由手工具圈定目標區域，避免邊緣效應。

背景校正：測量鄰近無信號區域的平均強度，從ROI中扣除。

共定位分析：

Pearson系數：范圍-1到1，≥0.5視為顯著共定位。

Manders系數：M1/M2分別表示通道A在B中的占比，≥0.7視為強共定位。

結構尺寸測量：

線掃描：沿結構長軸繪制強度曲線，FWHM即為寬度。

面積計算：二值化后統計像素數，轉換為實際面積（1像素=10nm2）。

四、常見問題與解決方案

圖像出現光斑或條紋：檢查激光共軸性，重新對準光路；清潔物鏡與濾光片。

熒光信號快速衰減：降低激光功率，增加防淬滅劑，縮短曝光時間；改用更穩定的染料（如ATTO系列）。

分辨率未達預期：優化depletion光強度，檢查物鏡數值孔徑（NA≥1.4）；校準PSF文件。

背景噪聲過高：調整探測器靈敏度，使用更窄的濾光片；屏蔽環境光，啟用冷卻模式。

超分辨STED顯微鏡的實驗技巧涵蓋樣品制備、參數優化與數據處理全流程。通過**控制熒光標記密度、激光共軸性及掃描參數，結合反卷積算法與定量分析方法，可顯著提升圖像分辨率與科學價值。掌握動態成像、多色對齊及光毒性管理策略，將助力科研工作者在細胞生物學、神經科學等領域揭示亞細胞結構的精細動態，推動生命科學的突破性進展。